宋保亮组发现新型胆固醇共价修饰蛋白丨BioArt特别推荐
BioArt按：长久以来hedgehog被认为是唯一被胆固醇修饰的蛋白，然而生命科学领域中的所谓“唯一”通常是用来被打破的。3月23日，Molecular Cell在线发表了来自武汉大学生命科学学院宋保亮教授团队与华东师范大学仇文卫副教授课题组合作完成的题为“Cholesterol modification of Smoothened is required for hedgehogsignaling”的研究论文，该研究发现了一个新的胆固醇修饰蛋白Smoothened (SMO)并阐明了该修饰的调控机制，这是时隔20年后发现的又一胆固醇共价修饰蛋白，颠覆了长久以来认为hedgehog是唯一被胆固醇修饰蛋白的认识。此外，值得一提的是，该研究不仅在细胞水平证明了胆固醇修饰对SMO的功能的必须性，并且在小鼠水平证明了胆固醇修饰在体内的作用。
论文解读：
Hedgehog信号通路是调节动物胚胎发育的经典信号通路之一，Hedgehog(HH) 基因是1980年由 Nusslein-Vollhard 和Wieschaus 在研究果蝇的突变体时发现 ，该基因突变会导致果蝇幼虫体表出现许多刺突，形似刺猬，故命名为 Hedgehog（下图）。
Hedgehog信号通路主要由信号分子Hedgehog（HH）、膜受体PTC、SM以及转录因子GLI2/3构成（下图）。随着近年来有关Hedgehog信号通路的深入研究，人们对其在肿瘤发生发展中的作用有了新的认识，并有望成为肿瘤治疗新的靶点。
图片引自：van den Brink, G. R. (2007). Hedgehog signaling in development and homeostasis of the gastrointestinal tract. Physiological reviews, 87(4), 1343-1375.
1992年有3个课题组分别独立报道了果蝇中的Hedgehog（hh）基因编码一种分泌蛋白，其中约翰霍普金斯大学Philip Beachy课题组在Cell发表了相关文章（下图）。
1996年，Philip Beachy课题组在Science发表文章报道了第一个也是20年中唯一一个胆固醇修饰蛋白，Hedgehog（下图）。
20年以来，虽然关于新的胆固醇修饰蛋白的猜想一直都有，但从来没有新的胆固醇修饰蛋白被报道。相对于经典的翻译后修饰，胆固醇修饰作为一种特殊的修饰一直没有很好的鉴定方法。针对这一热点领域，宋保亮研究团队和华东师范大学仇文卫实验室合作，合成了一种新的胆固醇探针，利用此探针建立了一套以点击化学反应和化学生物学为基础的新筛选方法（下图）。
结合大规模质谱鉴定，研究人员惊喜的发现，Hedgehog通路的重要下游信号转导蛋白SMO可以被胆固醇修饰。研究人员进一步利用质谱手段确认了SMO的胆固醇修饰，并鉴定到SMO的修饰位点在其N端的Asp95(D95)位，相应的生化试验也验证了这一点，SMO(D95N) 点突变可以完全阻止SMO的胆固醇修饰（下图）。
熟悉Hedgehog信号通路的人们可能知道，成熟Hedgehog蛋白可以结合其受体Patched（PTC），并释放PTC对SMO的抑制作用，SMO转运到纤毛上，从而激活下游的Gli转录因子，促进Hh靶基因的表达。但是，Hh和Patched在机制上是如何调控SMO活性的？这是Hh pathway 领域里的一大核心问题。宋保亮研究组发现，Hh可以促进SMO的胆固醇修饰，而Patched可以抑制其胆固醇修饰，从而证明了Hh是通过解除Patched对SMO的胆固醇修饰抑制来调控其活性的（下图）。该发现解决了长久以来困扰hedgehog 领域的一大难题。
胆固醇修饰SMO对其功能影响示意图
胆固醇修饰对Hh的运输及功能都有重要作用，那么SMO的胆固醇修饰有什么作用呢？为了回答这一问题，宋保亮研究组对SMO(WT)和SMO(D95N)进行了详细的分析，发现胆固醇修饰对SMO向纤毛上的转运是必须的。结合Gli荧光素酶实验，证明胆固醇修饰对其转导Hh信号也是必不可少的（下图）。
胆固醇修饰位点突变后，Smoothened（SMO）向纤毛的转运被完全阻止
为了进一步在体内研究胆固醇修饰对SMO功能的影响，该研究组构建了SMO-D99N（对应人源SMO中的D95N）的Knock-In小鼠。发现纯合的SmoD99N/D99N小鼠会造成胚胎致死（下图）。病理学研究表明，纯合SmoD99N/D99N小鼠出现了严重的胚胎和心脏发育障碍。并且小鼠的神经管中Hh下游基因的表达也显著降低。进一步的定量PCR进一步确认了Hh pathway下游基因表达的抑制。
纯合胆固醇修饰位点突变小鼠发育障碍并胚胎致死
以上研究证明，胆固醇修饰对SMO的活化有重要意义，提示SMO的胆固醇修饰可以作为一个治疗Hh相关癌症的新靶点。
值得一提的是，宋老师实验室是以研究胆固醇为主的脂类代谢实验室，在胆固醇代谢领域发表了多篇高水平论文（详见文末宋老师简介）。本课题是宋老师实验室拓展的一个新方向，跨界到Hh pathway领域，给人一种全新的感觉。
本研究的重要意义包括：1、发现了一种新的胆固醇修饰蛋白SMO，并鉴定了其修饰位点；2、证明Hh和patched可以通过调控SMO的胆固醇修饰来控制SMO的活性；3、通过Knock-In小鼠证明了胆固醇修饰在胚胎发育过程中的重要作用；4、本研究的结论提示SMO的胆固醇修饰提供了一个新的治疗Hh pathway 相关癌症的策略。
据悉，宋保亮课题组的学生肖旭和唐静洁博士为该论文的共同第一作者，宋保亮教授和华东师范大学化学与分子工程学院仇文卫副教授为共同通讯作者。本研究中所用到的各种新型探针都是由华东师范大学仇文卫教授课题组设计并合成的。本项研究工作还得到了许多课题组的支持。质谱数据由国家蛋白质中心黄超兰研究员课题组的彭超博士等完成，SMO功能分析实验得到了生化细胞所赵允研究员的大力支持。另外，研究过程中，也得到了生化细胞所李伯良研究员、周斌研究员、武汉大学殷雷教授、罗婕博士和韩强强博士等的支持和帮助。该工作得到了国家科技部和国家自然科学基金的支持。
后记：鉴于宋保亮老师这个工作的重要开创性意义，笔者借此机会就多说几句。笔者在与裴华东老师（北京蛋白质组研究中心研究员，青年千人）就这个工作交流的过程中，裴老师毫不掩饰的盛赞了这项工作，并评价这项研究应该是宋老师近年来最具代表性的工作之一。这项研究对于胆固醇这种新的蛋白质翻译后修饰来说是打开了一扇窗户，是开创性，会引领不少后续的相关研究。例如，可以从蛋白组学水平鉴定更多具有这种修饰的蛋白、发现可以识别这种修饰的reader、这种修饰是如何被精细调控以及相关的生物学功能研究等等。这项研究还告诉我们，生物学家和化学家合作的重要性，方法学在生命科学研究中的重要作用不容忽视，因为开创性的东西往往要比那些系统性的常规筛选要复杂的多，没有多少可以借鉴的例子。希望宋老师团队再接再厉，继续推动胆固醇修饰领域向前发展！
致谢：感谢蒋威博士对本文的贡献！
宋保亮，现任武汉大学生命科学学院教授、院长，国家“杰青”和长江学者特聘教授，万人计划科技创新领军人才入选者，国家重大科学研究计划首席科学家。1997毕业于南京大学生物科学与技术系，随后进入中科院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所攻读博士学位，师从李伯良研究员，2002年博士毕业。同年到美国德克萨斯大学西南医学中心从事博士后研究工作，师从Michael S. Brown 、Joseph L. Goldstein和Russell DeBose-Boyd（Michael S. Brown 和Joseph L. Goldstein因发现LDLR及其跟胆固醇代谢与家族性胆固醇血症的关系而获得1985年诺贝尔生理或医学奖）。2005年回到中科院上海生物化学与细胞生物学研究所任PI，期间曾任分子生物学国家重点实验室副主任（2012-2014），生化细胞所所长助理（2013-2014）。2014年始任武汉大学生命科学学院院长。宋老师实验室主要从事与心脑血管疾病发生密切相关的胆固醇代谢平衡调控的研究。首次提出并证明了小肠细胞对饮食胆固醇吸收的分子模型，发现了该途径中的多个蛋白因子（2014，Nature Medicine；2014，J Biol Chem；2011, PNAS; 2008，Cell Metabolism;）；深入探索了内源胆固醇合成的负反馈调控机制—HMGCR蛋白的受控降解(2007, Cell Metabolism；2005，Molecular Cell；2005，Cell Metabolism；2003，J Biol Chem)揭示了肝脏脂质合成与棕色脂肪能量代谢的联系（2012，Cell Metabolism）；构建了基于胆固醇合成负反馈调控途径的筛选体系，并获得了能同时降低胆固醇和甘油三酯的活性化合物白桦酯醇（2011，Cell Metabolism）。这些原创性成果不仅丰富了胆固醇代谢平衡调控的基础理论，并且对研发新型的降脂药物具有重要意义。最近宋老师课题组还在细胞内胆固醇动态运输的分子机制方面获得了突破性的研究成果（2015，Cell）。宋老师目前还担任JBC杂志编委和JMBC杂志副主编，此外还曾获得过谈家桢生命科学创新奖（2014）、中国青年科技奖（2013）、亚太Arthur Kornberg Memorial Award（2013）、陈嘉庚青年科学奖（首届，2012）等。主要研究方向包括：1）小肠胆固醇吸收的分子途径；2）细胞内胆固醇动态运输的分子机制；3）胆固醇代谢调控的信号转导途径和机理；4）胆固醇代谢的药靶系统及新药研发。实验室的长期目标是揭示胆固醇代谢的分子机制，发展治疗胆固醇相关疾病的新策略。
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